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western blot配胶配方
WesternBlot
基本原理及步骤
答:
(7)制备积层
胶
:按
配方
先向50ml离心管中加入ddH2O、30%丙烯酰胺制胶液、Tris-Hcl-6.8,涡旋使其充分混匀。再依次加入10%SDS、AP液(0.1g APS粉末+1ml ddH2O)、TEMED,再次涡旋使其充分混匀。(8)插梳子:弃胶板中的无水乙醇,注入积层胶,迅速垂直插入梳子。(9)凝胶:静置30min。(10...
有人有
western
blot
的Tris-乙酸胶的
配方
吗?还有相关电泳液的配方?急...
答:
D液——10%SDS:10g (2g)SDS溶于去离子水中,定容至100mL(20mL),加热至68℃助溶。E液——10%过硫酸铵:5g(0.5g)过硫酸铵,溶于50mL(5mL)去离子水中;现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。F液——TEMED(N-N-N`-N`-四甲基乙二胺)原液,室温保存。三、配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯...
western
blot配胶
时为什么上层胶会断裂
答:
一、配胶 注意一定要将玻璃板洗净,最后用ddH2O冲洗,将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干
。分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外),过滤后作为储存液避光存放于4度,可至少存放1个月,临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡,有条...
Western
blot
实验需要准备什么试剂和耗材
答:
- 加热样品至100°C使蛋白变性。- 冰上骤冷样品,然后直接上样至SDS-PAGE
胶
。- 电泳至染料接近胶底部,停止电泳。4. SDS-PAGE凝胶电泳 - 选择合适的分离胶浓度,准备凝胶。- 配制浓缩胶并组装凝胶。- 上样并电泳,注意调节电压和时间。5. 转膜 - 准备PVDF膜,并在转移缓冲液中进行预处理。- 组...
求胃癌细胞的
western
blot
步骤,可以直接写在小论文上发表的简洁版_百度...
答:
如果使用碧云天生产的
Western
及IP细胞裂解液,可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制,也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和
配胶
器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的
配方
。(2) 样品...
western
blot
具体操作步骤
答:
5、膜染色液:考马斯亮兰 0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。6、显色液:DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸镍胺 0.1ml;H202 1.0μl。三、操作步骤 (一)蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上...
western
blotting
的过程和原理
答:
1×loadingbuffer
配方
:10%甘油,50mMTris•Cl(pH6.8),2%β-巯基乙醇,0.2~0.5‰溴酚蓝,2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×,注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏,肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS,肝肾等组织2%即可。)(三)电泳1.上样前将胶板下的气泡赶走。2.所有蛋白样品调至等浓度后上样,样品两侧的泳道用...
westernblot
在不同蛋白时可以剪膜吗
答:
10%的
胶
,浓度高,迁移慢一些,如果都在相同位置裁,这里看到条带,6,8%的胶,膜需要裁得更靠下缘。或者把之前裁掉的膜的下半部分再拿来做做实验试试。当然,电泳时的各种因素也会有影响,但是如果其他配置完全一样,就是胶浓度变化了的话,上述原因是需要考虑的。
有谁做过350KD蛋白的
Western
blot
答:
建议梯度
胶
跑,上面6%,线面10%,考虑到下面还有内参,电泳条件正常跑就好,可以多跑会儿,保证内参跟目的蛋白都在胶上就行。转膜100V3.5小时,强烈建议用冰盒,有条件的话建议4度冷室转,因为最后一小时电流会很大,当然也可以35V过夜转膜,可能效果会比较好。
Western
blot
实验最常见的10个问题及解决方案
答:
一般是与转膜和显影的操作有关,转膜前尽量将膜平衡,并注意
胶
和膜之间避免气泡,显影时膜与X光片间也应避免气泡。6、存在散在小圆斑 是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致,解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存,使用时勿混匀,仅用上层。7、
Western
Blot
化学发光(ECL)淬灭的原因?Western Blot“淬灭”...
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