过表达载体构建方法介绍如下:
1 可以用酶切连接法(传统),也就是将目的基因和载体都用相同的限制性酶(或同尾酶)酶切,然后用T4连接酶连接,转化到感受态细胞,筛选出阳性克隆;
2 重组法,利用同源重组将外源基因整合到表达载体,外源基因可以先联到一个含重组位点的中间载体,然后用重组酶将其置换到表达载体,转化到感受态细胞,筛选出阳性克隆。
拓展介绍
过表达载体主要是将目的基因的编码区(CDS)构建到相应的质粒或者病毒载体中,达到在目的基因过量表达的作用。
过表达载体的主要元件:Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗药筛选gene。
花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S是组成型启动子,具多种顺式作用元件。其转录起始位点上游-343~-46bp是转录增强区,-343~-208和-208~-90bp是转录激活区,-90~-46bp是进一步增强转录活性的区域。
Mitsuhara等利用CaMV35s核心启动子和CaMV 35S启动子的5'端不同区段与烟草花叶病毒的5'非转录区(omega序列)相连,发现两个CaMV 35S启动子-419~-90序列与omega序列串联后,将GUS构建在该启动子后面转入植株中,获得很高的GUS表达活性。
另一种高效的组成型启动子Cs-VMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus,CsVMV)中分离的。该启动子-222~-173bp负责驱动基因在植物绿色组织和根尖中的表达。
在双子叶植物中过量表达某个目的基因大多采用人工改造后的CaMV 35S启动子,在单子叶植物如水稻中常采用泛素启动子。除了上面提到的高效表达的组成型启动子外,在植物发育生物学研究中经常使用的还有组织特异性表达启动子,如根特异启动子mas2、叶肉细胞特异启动子C4Pdk和种子特异启动子napinB等。