为什么用两种限制酶切有两种不同的目的基因
用A、B两种酶切出目的基因来，可以防止自环。然后再用A、B酶去切质粒，也可防自环，且得到与目的基因互补的黏性末端，才能连接目的基因。所以，既要用两种不同酶切，还要保证质粒和目的基因一样的两种酶。两种不同的限制性内切酶识别并切割的序列是不同的,也就是两种酶分别切割了基因和载体时,产生了两个切口,这两个切口不是粘性末端,不能互补配对,所以不可能连接在一起,如果用一种酶来切那么这样基因中或者是载体上就会有相同的粘性末端,这样基因本身除了切下来的那段之外,剩下的部分在连接酶作用下相同的粘性末端就会配对连接,同样载体也会继续连接成环,基因和载体连在一一起也有,而且首尾的顺序也有两种,连接体系跑电泳结果会有4个条带,至少是4种,而且就算那个连接后的片段大小符合你要求的那段纯化后也有一部分是不能表达的.哪四种就不用写了,你肯定知道的,不能表达的那部分就是顺序不对的,这就是同种酶切连接的缺陷性.
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