western blot实验步骤

如题所述

western blot实验操作步骤如下:

1. 准备样品

1)制冰,准备冰盒。

2)配制细胞裂解液:根据细胞数量确定所需裂解液:50ul/六孔板一孔 。

裂解液配方:100ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1ul PMSF

3)按实验需要准备好细胞:去掉培养基,1×PBS洗3次(去掉培养基中的血清),每个孔(6孔板)加入适量的裂解液。迅速用细胞刮刮下细胞并转移至1.5ml管中,置于冰上20min,振荡混合后,再置冰上10min。


2. SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳:制备分离胶(5ml/gel)



3. 膜转移

1) 切胶,按Marker指示和目的条带的位置切胶(注意将胶切角做记号),将洗脱的胶浸入转膜缓冲液中15分钟。

2) PVDF膜做好记号后先浸入甲醇中1分钟,再连同4张3mm滤纸和海绵浸入转移缓冲液中15分钟。

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