四区划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。
注意事项：
1、平板应较硬、较厚、表面干燥；划完A区后必须烧去接种环上的残菌，待冷却后再划B区；线条宜平行、密集、整齐，以充分利用平板面积。
2、划线时第一区域不能与最后区域相连。平板划线法通过反复划线分离,可获得微生来物的纯种。
以上内容参考：百度百科-四区划线法
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