广州地铁二号线自2002年12月29日起开始运营，起始站位于海珠区的新港东路。线路最初呈"L"型走向，经过华南快速干线、黄埔涌、新港中路，然后穿过客村立交进入新港西路，继续经过晓港立交，沿着昌岗东路西行，接着转向北进入江南大道中，沿着大道北上，大约在海珠桥西侧50米处跨越珠江。这条线路经过海珠广场、广州起义路，途经人民公园，最终到达人民公园西侧，经过连新路、东风中路，穿越越秀公园和解放北路，抵达广州火车站，终点为白云区的三元里大道与广园西路交汇处。
2010年9月25日以后，线路发生了一些变化。之前被称为"老二号线"的三元里至万胜围区间停止运营，万胜围至晓港段移交给8号线运营。此时的二号线走向变为南北型，连接了白云区和番禺区，起始站改在番禺区的广州南站。它穿越洛浦板块，过珠江进入海珠区，途径海珠客运站和东晓南路，随后向北进入江南大道，继续沿江南大道北上，并在海珠桥西侧约50米处过江。经过海珠广场和广州起义路至人民公园，再转向人民公园西侧，经过连新路、东风中路，穿越越秀公园和解放北路，最终到达广州火车站附近的三元里大道与广园西路交汇点，继续沿白云区的白云新城中轴线，终点站设在嘉禾望岗。
广州地铁二号线，代表颜色是蓝色。首通段（三元里─晓港）于2002年12月29日开始试运营。2003年6月28日地铁二号线三元里─琶洲段开始正式营运。二号线使用了很多国内乃至国际上都处于领先地位的技术。广州地铁二号线是世界上全线都在建成时就安装了屏蔽门的地铁线路之一。屏蔽门可确保乘客候车时的安全，还能节省能源消耗。目前连接海珠区至白云区的三元里。首次采用架空刚性接触网。2013年1月8日开行工作日早高峰短线“三元里到江泰路。