怎样提取藻蓝蛋白

Question

如题所述

Answer 1

一、实验原理
1.冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下融化。如此重复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。
2.盐析法：盐在水溶液中电离形成的正负离子可吸引水分子，从而破坏蛋白质的水花膜，中和部分电荷，致使蛋白质聚集沉淀，并从溶液中析出。由于各种蛋白颗粒的大小、所带电荷的多少及其亲水程度的不同当使用某种中性盐进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。 3.DEAE－纤维素：英文名称DEAE－Cellulose，二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基.弱碱性阴离子交换剂。 原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换。性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。
二、实验步骤
1. 藻蓝蛋白的提取
取螺旋藻粉10g,，倒入塑料瓶中，加提取液100ml，封住瓶口置低温（－20℃）下冰冻一定时间，然后取出置室温下融化，再放置低温（－20℃）下，如此反复冻融3次,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。 实验现象:解冻前:墨绿色固状(略带紫色)解冻后:墨绿色溶液 冻融所得溶液分两次在4000rpm下高速离心10min，得到亮蓝色上清液，用小烧杯收集，弃去下层墨绿色沉淀。
2、盐析法沉淀藻蓝蛋白：
（1）藻蓝蛋白盐析曲线的制作
取六支试管编号1-6，分别加入初提液5ml，1-4号试管中加入饱和硫酸铵溶液(100ml溶液中加入69.7g硫酸铵)2、3、4、5ml，再加入蒸馏水3、2、1、0ml，向5-6号试管中加入固体硫酸铵0.66和1.37g，再加入饱和硫酸铵溶液5ml，充分摇晃溶解后，冰箱中静置半小时以上，放入离心机中4000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用5ml，0.02mol/L pH6.5的磷酸缓冲液溶解。以硫酸铵饱和度为横坐标，藻胆蛋白浓度为纵坐标作图，得藻蓝蛋白盐析曲线。
C=（A620-0.474A650）/5.34 （mg/ml）
A620、A650分别为在620、和650nm下的吸光度，以磷酸缓冲液调零。
3、藻胆蛋白纯化
（1）称取 (NH4)2SO4固体粉末，分多次缓慢加入小烧杯中，边加边搅拌，使溶液的(NH4)2SO4饱和度达到20％（11.4%）。冰箱中放置半小时，在4000rpm，离心10min，离心沉降后，取得亮蓝色上清液，弃去蓝色沉淀。 加入硫酸铵使溶液的(NH4)2SO4浓度达到50％（31.3%，要扣除前面已加的硫酸铵的量）。在4000r下高速离pm心10min，离心沉降后，取得深蓝色沉淀，弃去黄绿色上清液。加不超过15ml蒸馏水溶解所得沉淀备用(水因尽量少,有利于渗析)。
（2）剪取约25cm长的透析袋，放入烧杯中煮沸5min（从水沸开始计时），将其中一头用细线扎住，对折后再用细线扎住。将之前溶解沉淀的溶液倒入层析袋中。放入蒸馏水中，每一小时换一次透析液. 透析后放入PEG-6000固体颗粒中，进行浓缩。
（3）取一支层析柱，检漏后清洗干净，用两个铁夹固定在铁架台上，要从正面和侧面检查是否竖直，如不竖直则作出调整。称取20g DEAE—纤维素—52于一烧杯，用0.5MNaCL和0.5MNaOH溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。接着用0.5MHCL溶液融胀20min，再用蒸馏水洗至中性。最后用0.02M，pH6.5磷酸缓冲液平衡过夜。轻轻搅拌溶液，均匀地倒入柱中。柱中液面上要保留2～3cm的空间，之后液面每下移到原刻度位置，就补水到相应高度，使蒸馏水始终高于填料2cm以上。
（4）将准备好的层析柱中的缓冲液放出，待液面比填料高出大约只有1cm时，关闭柱开关。用胶头滴管吸取透析后的藻蓝蛋白粗提液，伸入柱液面内，沿管壁以很慢的速度将粗提液滴到液面中部，待液面升高后可以加快滴加速度。待液面离柱口只有大约2cm距离时，把开关完全打开，一边继续滴加粗提液。
（5）待粗提液液面比填料高出大约只有1cm时，滴加50ml，0.02M，pH6.5磷酸缓冲液冲洗残余粗提液，不要一次加入，应先加少量把残余粗提液冲洗干净(至溶液澄清为止)，再大量加入。最后加入0.5MNaCl—0.02M，Ph6.5磷酸缓冲液。
（6）小心观测，待有浅蓝色溶液流出时，马上开始收集，2ml一管（共收集10管）。收集到试管后，试管内溶液的颜色变化：浅→深→浅 以磷酸缓冲溶液为空白对照管,用分光光度计测其A620nm，A650nm
（7）根据A620nm、A650nm计算各管的藻蓝蛋白浓度。

Answer 2

螺旋藻是人们公认的一种高级营养食品，它除了含有近60%的蛋白质和丰富的维生素、微量元素外，爱含有10%左右的藻蓝蛋白，过去人们都是直接食用或添加到其他食物中食用。近年的大量研究试验表明，藻蓝蛋白有一定的抗癌作用，还有抗射线辐射作用，因此人们开始设法提取藻蓝蛋白。螺旋藻受其细胞壁的保护，采用机械方法很难达到破壁效果，所以目前提取藻蓝蛋白的方法通常采用化学破壁法。化学破壁法是用化学缓冲液破坏细胞壁后提取藻蓝蛋白的方法。虽然它可有效破壁，但也给下一步分离造成了很大麻烦，需要花费较多的工序，使运行成本大幅上升。 将含有水分的螺旋藻置于0℃以下冻结成冰，然后取出在0℃以上解冻，利用水灾0℃-4℃的膨胀特性，破壁析出藻蓝蛋白。为了获得更好的破比率，螺旋藻的含水率为50%-95%，冻结成冰时要保持10分钟以上。 这种技术完全采用了物理方法将螺旋藻的细胞壁破裂，不使用任何化学添加剂，同时耗费的能源很少，因此方法很简单，容易实施，保全了螺旋藻的固有成分，藻蓝蛋白的生物活性不受破坏；采用此方法所需要的设备简单，整个破壁工序需要的时间短，可大大提高生产效率，降低成本；较为合适的螺旋藻含水率及冻结保持时间，可最大程度地提高破比率；螺旋藻采用破壁提取藻蓝蛋白后，可消除绝大多数人难以接受的腥味，使食用口感更好。 摘自 http://www.sd1861.com/xiangzhipin48.htm 参考于 http://www.sd1861.com/duozhipin1.htm本回答被提问者采纳

Answer 3

，在螺旋藻粉中加入缓冲溶液，经搅匀后进行高压 匀质破壁，得到螺旋藻破壁液，再经离心分离后取上清液，分别使用2μm、0.45μm及0.2μm的微滤膜进行过滤，过滤后得到藻蓝蛋白粗提取液，然后以 流速为2～5mL/min过组合型树脂进行脱色纯化，收集洗脱液，即为藻蓝蛋白提取液，最后进行高速离心喷雾干燥，收集粉末，即得到藻蓝蛋白。本发明能使 藻蓝蛋白最大量的提取出来，且不会造成二次污染，提取螺旋藻中藻蓝蛋白的提取率为90.0%以上，产品纯度达到A620/A280>3.2。