基因克隆

如题所述

大量的木霉基因序列已通过不同方法克隆获得,这些方法包括差分杂交、基于蛋白质序列合成的探针、通过异源基因设计的探针或根据同源序列设计合成引物进行PCR扩增等。截至2013年12月25日,在NCBI的GenBank数据库中,以T.为关键词进行搜索,共能检索到23027条记录。滤掉基因组测序的scaffold序列,剩余记录项中数量最多的是与木霉菌分类和系统发育研究有关的基因序列,包括rDNA(5.8S、18S、28S)、ITS、翻译延伸因子(translation elongation factor)、钙调蛋白(calmodulin)、肌动蛋白(actin)、微管蛋白(tubulin)、RNA聚合酶II亚基(RNA polymerase II subunit)、ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase)等。在其他功能比较明确的1500余个基因记录中,几丁质酶编码基因数量最多,有614个,包括内切几丁质酶42基因(endochitinase 42,ech42)、几丁质酶18-5基因(chitinase 18-5,chi18-5)、几丁质酶18-13基因(chitinase 18-13,chi18-13)、几丁质酶18-15基因(chitinase 18-15,chi18-15)、几丁质酶18-17基因(chitinase 18-17,chi18-17)、几丁质酶33 基因(chitinase 33,chit33)等;还有葡聚糖酶基因55个,例如β-1,4-内切葡聚糖酶(endo-1,4-beta-glucanase)、β-1,3-内切葡聚糖酶、β-1,6-内切葡聚糖酶(endo-1,6-beta-glucanase)、β-1,3-外切葡聚糖酶(beta-1,3 exoglucanase)等;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gpd)基因有50个;纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase,cbh)基因有49个;蛋白激酶基因有30个,包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,Tmk)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase)等;疏水蛋白(hydrophobin)基因25个;木聚糖酶及相关基因有20个,包括β-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-beta-xylanase)、木聚糖酶调节蛋白(xylanase regulator)等;蛋白酶(protease)基因16个;可能与次级代谢产物形成有关的基因有12个,包括非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase)基因、多肽合成酶(polyketide synthetase)基因等;氨基葡萄糖苷酶12个,包括N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D- glucosaminidase)、外切-β-D 氨基葡萄糖苷酶(exobeta-D-glucosaminidase)等;葡萄糖苷酶(glucosidase)基因13个;膨胀因子(swollenin)基因12个;硝酸还原酶基因(nitrate reductase,euknr)有12个;植酸酶(phytase)基因6个;漆酶(laccase)基因5个等。

结论

木霉菌基因组测序信息的获得大大加速了木霉菌的研究进展,这些遗传物质基础决定了不同木霉菌的生存能力与缺陷,从而也决定了它们不同的生活方式。基因组序列信息为新的研究方向提供了动力,例如,大量的小分子分泌蛋白、细胞壁降解酶的新种类和那些假定的次级代谢产物生物合成酶都属于新的研究方向,需要从遗传学、化学和生理学领域协同开展研究。多个木霉菌基因组序列的获得,也将有助于不同物种间研究成果的交流。例如,通过将T.reesei中纤维素酶的转录因子、信号组分等调控模式与生防木霉菌进行比较,将为了解木霉菌不同生活方式的生理机理提供有意义的新发现。通过对野生型及突变菌株进行高通量的基因组、转录组,以及代谢通路分析,将会鉴定出与生物质降解、生物防治及人类致病性相关的新基因。今后的努力方向将是整合这些生理过程和分子图谱,然而,新问题会随之出现,并最终推动我们离开电脑走向实验台,去验证诸多假设的正确性。

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