第一架进行试飞的F-35是空军陆上型F-35A，编号AA-1。试飞时间是2006年12月15日在德州沃斯堡展开。
第二架F-35A（编号AF-1）于2009年1月14日进行第一次试飞。
第三架F-35A（编号AF-2）于2010年4月20日试飞。
2015年6月，美国生产线上的日本F-35A初号机（AX-1）第一块预制件已经开始准备，该机预计将于2016年8月下线。 可以进行垂直起降的F-35B（编号BF-1）于2008年6月11日进行第一次试飞，不过起飞的过程仍是采用传统的滑行方式。BF-1同时也是19架系统发展与展示（System Development and Demostration）机组当中的第二架，以及第一架采用重量最佳化生产程序的飞机。 第二架F-35B（编号BF-2）于2009年2月25日试飞。 第三架F-35B（编号BF-3）于2010年2月2日试飞。 第四架F-35B（编号BF-4）于2010年4月7日试飞。 2011年1月，美国防部长盖茨宣布将进行为期两年的F-35B生产暂停，以期重新设计以提高表现，如果不成功将会取消该子型号。洛克希德-马丁副总裁Tom Burbage曾说大部分的F-35发展延误都是由于B型造成的。而陆战队打算先一步不经足够的验收部署F-35B初始作战能力。2012年1月20日继任盖茨的Leon Panetta称“所有人都相信F-35B已取得了足够的进展”而恢复生产计划。
2012年12月3日, 1架F-35B试验机BF-3完成首次空中武器投放。在大西洋上空首次完成了空投227公斤级别的GBU-12宝石路II激光制导炸弹试验任务。 海军舰载型F-35C于2010年6月6日在沃斯堡进行第一次飞行。这架编号CF-01的F-35C一共飞行57分钟，飞行员是洛克希德-马丁公司的试飞员Jeff Knowles，Jeff同时也担任过F-117战斗机的首席试飞员，翼面积和尾翼面积比A/B型大，将装备在福特级核动力航空母舰上。
CF-01是在2009年7月28日出厂，然而一些组件运交延迟，加上设计方面的修改，导致第一次试飞的时间从2009年底延后到2010年6月。初期试飞计划包括15次飞行，接着进行结构偶合和震动测试。接着在2010年10月会将CF-01送到马里兰州帕特森河海军基地与F-35B一同进行后续的试飞工作。
2013年6月，洛·马公司在佛罗里达州埃格林空军基地向美国海军第101战斗机中队(VFA)交付首架F-35C“闪电 II”航母舰载型。
