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3.碱çä½ç¨ï¼DNAè碱RNAæ被碱水解ã
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¶æ®çæ´»æ§æ¯åæ¥ç 60%ï¼å¨95âä¸ååº2håå
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æ©ç®çåºå æ©å¢æ¾å¤§å ç¾ä¸åãå°è¾¾å¹³å°æ(Plateau)æé循ç¯æ¬¡æ°åå³äºæ ·åä¸æ¨¡æ¿çæ·è´ã
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¥ç¬¬äºå¨æåï¼å¼ç©é¤ä¸åå§æ¨¡æ¿ç»åå¤ï¼è¿è¦åæ°åæçé¾(å³âé¿äº§ç©ç段â)ç»åãå¼ç©å¨ä¸æ°é¾ç»å æ¶ï¼ç±äºæ°é¾æ¨¡æ¿ç5â端åºåæ¯åºå®çï¼è¿å°±çäºè¿æ¬¡å»¶ä¼¸çç段3â端被åºå®äºæ¢ç¹ï¼ä¿è¯äºæ°ç段çèµ·ç¹åæ¢ç¹é½éå®äºå¼ç©æ©å¢åºå以å
ãå½¢æé¿çä¸è´ç âç产ç©ç段âãä¸é¾çåºâç产ç©ç段âæ¯æææ°åæ°å¢å ï¼èâé¿äº§ç©ç段âå以ç®æ¯åæ°å¢å ï¼å ä¹å¯ä»¥å¿½ç¥ä¸è®¡ï¼ è¿ä½¿å¾PCRçååºäº§ç©ä¸éè¦å纯åï¼å°±è½ä¿è¯è¶³å¤çº¯DNAç段ä¾åæä¸æ£æµç¨ã
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¶è®¾è®¡äºè¡¥çå¯¡æ ¸è·é
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设计å¼ç©åºéµå¾ªä»¥ä¸ååï¼
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â¡å¼ç©æ©å¢è·¨åº¦ï¼ 以200-500bp为å®ï¼ç¹å®æ¡ä»¶ä¸å¯æ©å¢é¿è³10kbçç段ã
â¢å¼ç©ç¢±åºï¼G+Cå«é以40-60%为å®ï¼G+C太å°æ©å¢ææä¸ä½³ï¼G+Cè¿å¤æåºç°éç¹å¼æ¡å¸¦ãATGCæ好éæºåå¸ï¼é¿å
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dNTPçè´¨éä¸æµåº¦ dNTPçè´¨éä¸æµåº¦åPCRæ©å¢æçæå¯åå
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æé«æµåº¦åï¼ä»¥1M NaOHæ1M TrisãHCLçç¼å²æ¶²å°å
¶PHè°èå°7.0ï½7.5ï¼å°éåè£
ï¼ -20âå°å»ä¿åãå¤æ¬¡å»èä¼ä½¿dNTPé解ãå¨PCRååºä¸ï¼dNTPåºä¸º50ï½200umol/Lï¼å°¤å
¶æ¯æ³¨æ4ç§dNTPçæµåº¦è¦ç¸ç( çæ©å°é
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¶ä¸ä»»ä½ä¸ç§æµåº¦ä¸åäºå
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³é®ç¯èä¹ä¸ï¼ä¼ ç»çDNA纯åæ¹æ³é常éç¨SDSåèç½é
¶Kæ¥æ¶åå¤çæ æ¬ã SDSç主è¦åè½æ¯ï¼ 溶解ç»èèä¸çèç±»ä¸èç½è´¨ï¼å è溶解èèç½èç ´åç»èèï¼å¹¶è§£ç¦»ç»èä¸çæ ¸èç½ï¼SDS è¿è½ä¸èç½è´¨ç»åèæ²æ·ï¼èç½é
¶Kè½æ°´è§£æ¶åèç½è´¨ï¼ç¹å«æ¯ä¸DNAç»åçç»èç½ï¼åç¨ææºæº¶åé
ä¸æ°¯ä»¿æ½ææèç½è´¨åå
¶å®ç»èç»ä»½ï¼ç¨ä¹éæå¼ä¸éæ²æ· æ ¸é
¸ãæåçæ ¸é
¸å³å¯ä½ä¸ºæ¨¡æ¿ç¨äºPCRååºãä¸è¬ä¸´åºæ£æµæ æ¬ï¼å¯éç¨å¿«éç®ä¾¿çæ¹æ³æº¶è§£ç»èï¼è£è§£ç
åä½ï¼æ¶åé¤å»æè²ä½çèç½è´¨ä½¿é¶åºå 游离ï¼ç´æ¥ ç¨äºPCRæ©å¢ãRNA模æ¿æåä¸è¬éç¨å¼ç¡«æ°°é
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¶Kæ³ï¼è¦é²æ¢RNaseé解RNAã
Mg2+æµåº¦ Mg2+对PCRæ©å¢çç¹å¼æ§å产éææ¾èçå½±åï¼å¨ä¸è¬çPCRååºä¸ï¼åç§dNTPæµåº¦ä¸º200umol/Læ¶ï¼Mg2+æµåº¦ä¸º1.5ï½2.0mmol/L为å®ãMg2+æµåº¦è¿é«ï¼ååºç¹å¼æ§éä½ï¼åºç°éç¹å¼æ©å¢ï¼æµåº¦è¿ä½ä¼éä½Taq DNAèåé
¶çæ´»æ§ï¼ä½¿ååºäº§ç©åå°ã
PCRååºæ¡ä»¶çéæ©
PCRååºæ¡ä»¶ä¸ºæ¸©åº¦ãæ¶é´å循ç¯æ¬¡æ°ã
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éå·å´è³40 ï½60âï¼å¼ç©éç«å¹¶ç»åå°é¶åºåä¸ï¼ç¶åå¿«éå温è³70ï½75âï¼å¨Taq DNA èåé
¶çä½ç¨ä¸ï¼ä½¿å¼ç©é¾æ²¿æ¨¡æ¿å»¶ä¼¸ã对äºè¾çé¶åºå (é¿åº¦ä¸º100ï½300bpæ¶)å¯éç¨äºæ¸©åº¦ç¹æ³ï¼ é¤åæ§æ¸©åº¦å¤ãéç«ä¸å»¶ä¼¸æ¸©åº¦å¯åäºä¸ºä¸ï¼ä¸è¬éç¨94âåæ§ï¼65âå·¦å³éç«ä¸å»¶ä¼¸(æ¤æ¸©åº¦Taq DNAé
¶ä»æè¾é«çå¬åæ´»æ§)ã
â åæ§æ¸©åº¦ä¸æ¶é´ï¼åæ§æ¸©åº¦ä½ï¼è§£é¾ä¸å®å
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åµä¸ï¼93âï½94âlmin足以使模æ¿DNAåæ§ï¼è¥ä½äº93âå é延é¿æ¶é´ï¼ä½æ¸©åº¦ä¸è½è¿é«ï¼å 为é«æ¸©ç¯å¢å¯¹é
¶çæ´»æ§æå½±åãæ¤æ¥è¥ä¸è½ä½¿é¶åºå 模æ¿æPCR产ç©å®å
¨åæ§ï¼å°±ä¼å¯¼è´PCR失败ã
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