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±æ¥ååºå (æ¯å¦CAT,β-Gal,GUS)ä¸å¤ä¾¿å©,å 为åèªçæµè¯åå¦,å¤çè¦æ±,æ£æµç¹ç¹åå¨å·®å¼ãPromegaæä¾ä¸ç§å
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对ç
§, 使å¦ä¸ä¸ªæ¥ååºå çæ£æµåä¸åãæ£æµåºå 表达æ¶åæ¥ååºå é常ç¨æ¥ç¬æ¶è½¬æå¹å
»ç»èï¼å¸¦æå®éªæ¥ååºå çè½½ä½å
±è½¬æ带æä¸åçæ¥ååºå ä½ä¸ºå¯¹ç
§ç第äºä¸ªè½½ä½ãé常å®éªæ¥ååºå å¶èå°è°æ§çå¯å¨å, ç 究è°æ§åºå çç»æåççåºç¡ãæ¥ååºå 表达活åçç¸å¯¹æ¹åä¸å¶èè°æ§å¯å¨å转å½æ´»åçæ¹åç¸å
³ï¼å¶èå°ç»æåå¯å¨åç第äºä¸ªæ¥ååºå ï¼æä¾è½¬å½æ´»åçå
对ç
§, 使æµè¯ä¸è¢«å®éªæ¡ä»¶ååæå¹²æ°ã
éè¿è¿ç§æ¹æ³, å¯åå°å
å¨çååå ç´ æåå¼±çå®éªåç¡®æ§, æ¯å¦, å¹å
»ç»èçæ°ç®åæ´»åçå·®å«, ç»è转æåè£è§£çæçã
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¶,ç»åæ°¯éç´ ä¹é
°è½¬ç§»é
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¶(β-Gal), æè¡èéé
¸ç³è·é
¶(GUS)çåæ¥ååºå ,è¿å å¹´å·²æ®é使ç¨ãä½è¿äºåæ¥ååºå ç»ååå¼±äºè§å
ç´ é
¶æä½çä¼å¿ , æ¯å¦è§å
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须注æä¸è¦è¶
è¿è¿äºèå´, å
æºæ§ç»èæ´»åä¹ä¼å¹²æ°è¿ç±»æ¥ååºå ç使ç¨ã许å¤ç±»åçç»èæå
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å»ä¹é
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¶æ´»åå¹²æ°CATæ´»åæµè¯ã尽管å¨é«æ¸©ä¸é¢å¤çç»èè£è§£æ¶²(1,2), ä¼éä½å
æºæ§Î²-GalåCATæµè¯çå¹²æ°ï¼ä½è¿äºå¤çä¹ä¼å¿«é失活è§å
ç´ é
¶ãå æ¤,å¨æ¤ç±»åæ¥ååºå æ£æµä¸, å¿
须以ä¸åçæ¥éª¤åå«å¤çå
±è½¬æçç»èè£è§£æ¶²ã
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è ( Renilla reniformis ) åè§å
ç´ é
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ç´ é
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æ¥ååºå çæ´»åãè¤ç«è«è§å
ç´ é
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¶æ´»åä¸éç¿»è¯å修饰 (3,4), å¨ç¿»è¯åå³å¯ä½ä¸ºéä¼ æ¥ååºå ãå¨ ATP,Mg 2+ å O 2 åå¨ä¸ï¼éè¿ç²è«è§å
ç´ çæ°§åååºåå
( å¾ 1) ãå¨å¸¸è§ååºæ¡ä»¶ä¸ , è§å
ç´ çæ°§ååçæ¶ , 以è§å
ç´ -AMP ä½ä¸ºä¸é´ä½ , 转æ¢é常ç¼æ
¢ãç»æ , å¨åºç©åé
¶æ··åå , æµè¯åå¦äº§ç"éªç"çå
, 并è¿
éè¡°åãä¸å©åçæµè¯è¯å , å®éè¤ç«è«è§å
ç´ é
¶æ´»å , æºå
¥äºè¾
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¶ A(CoA), å¢å¼ºå¿«éé
¶è½¬æ¢æ¥æé«ååºå¨åå¦ (5), 导è´æç»ç"éªç"åå
ä¿¡å· ( å¾ 2) ã
å¾ 1ç±è¤ç«è«åRenillaè§å
ç´ é
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¶ï¼ä¸ä¸ª 36 kDaåäºåºèç½è´¨ï¼çº¯åèªå¤©ç¶æ¥æºç Renilla reniformis (6)ï¼å«æ3%ç碳水ååç©ï¼ä½æ¯åè¤ç«è«è§å
ç´ é
¶ä¸æ ·ï¼é
¶æ´»åä¸éç¿»è¯å修饰ï¼å¨ç¿»è¯åå³å¯ä½ä¸ºéä¼ æ¥ååºå ãæµ·æ´è
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ååºï¼å©ç¨O 2 åæµ·æ ·è
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¢å°è¡°å(å¾2)ã
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§" æ¥ååºå )ãå æ¤ï¼DLRæµè¯ç³»ç»æ´åäºä¸¤ä¸ªæµè¯åå¦ï¼å¯¹å
±è¡¨è¾¾ç两个æ¥ååºå ä½å¿«éå°å®éï¼é
¶æ¥èªè½¬æç»èè£è§£æ¶²ï¼ææ ç»è转å½/ç¿»è¯ååºã
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ç´ é
¶æµè¯ç线æ§èå´å»¶ä¼¸è¾¾é
¶æµåº¦ç8个æ°é级ï¼å¯æµå®â¤1fg (大约10 -20 æ©å°)çå®éªæ¥ååºå é
¶(å¾3A)ãç¨åè§å
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¶æ¥ååºå æµè¯ç³»ç»ï¼ æµ·æ´è
è è§å
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¶ç线æ§èå´è¾¾é
¶æµåº¦ç7个æ°é级ï¼è¾ä½çåºéæ¯â¤ 10fg (大约3Ã10 -19 æ©å°)ç对ç
§æ¥ååºå é
¶(å¾3B)ï¼å¹¶ä¸è¿ä¸¤ä¸ªé
¶çç¹å¼æ´»åç¸ä¼¼ã
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¶æ¥ååºå æµè¯ç±è¤ç«è«åRenillaè§å
ç´ é
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»æ¿)å
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ControlåpRL SV40è½½ä½DNAãç»èç¨PBSæ´æ¶¤åï¼å å
¥400μl PLBå¶æè£è§£æ¶²ãå°20μlå°éç»èè£è§£æ¶²å100μlè§å
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ç´ é
¶çæ´»åç«å³ç¨è§å
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§åº¦ä»ªæ£æµ(ç»çº¿ç¤ºè¸ª)ã100μl Stop &Glo TM è¯åå å
¥å°è§å
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§åº¦ä»ªç®¡ä¸ï¼æ¹®çè¤ç«è«è§å
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ç´ é
¶çæ´»å(ç²çº¿ç¤ºè¸ª)ãTurner Designs åå·20/20è§å
ç
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æ计ç®æºç¨æ¥ç¤ºè¸ªè§å
åå°ï¼12ç§å
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ä¿¡å·ï¼å¯å¨å¶å¤è£è§£æ¶²åç«å»è¿è¡ï¼ ä¸éå°æ ·ååæå°ç»åæä½é¢å¤çå¤çãå æµ·æ´è
è åè¤ç«è«è§å
ç´ é
¶ååç°éªçåååºå¨åå¦ï¼ä½åè§å
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é常DLRæµè¯ï¼å¤§çº¦éè¦30ç§éå®æï¼å¦å¾4æ说æãèµ·å§è¤ç«è«è§å
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被湮çï¼åæ¶æ¿æ´»æµ·æ´è
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ï¼Stop & Glo TM è¯åæ¹®ç大äº10 5 滴度è¤ç«è«ååºçåå
ä¿¡å·(å¾5)ï¼å¹¶åæ¶æ¿æ´»æµ·æ´è
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¥Luciferase Assay Reagent II (LAR II) , Stop & GloTM è¯åã
PLBè£è§£æ¶²
PLBè£è§£æ¶² (Passive Lysis Buffer)ï¼ç»ç¹å«è®¾è®¡å¯ææè£è§£å¹å
»çåºä¹³ç»èï¼èä¸å¿
å®ä¸è´´å£ç»èæä½å»è循ç¯ã尽管PLB设计åºç¨äºè¢«å¨è£è§£è¿ç¨ä¸ï¼ä½å®å¯é çè£è§£ææåæ ·æçäºä½¿ç¨å¸¸è§å¤çæ¹æ³å¶ä½çè£è§£æ¶²ãæ 论使ç¨ä½ç§è£è§£æ¹æ³ï¼å¯¹å¹å
»çåºä¹³ç»èèè¨ï¼éæ¾å°PLBè£è§£æ¶²ä¸çè¤ç«è«åæµ·æ´è
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¶æ¯å®éåå¯é ç (å¾6)ã被å¨è£è§£æ¶²çä¸ä¸ªææ¾ä¼ç¹ï¼æ¯å¯ä»¥æå¶ä½æ°´å¹³çéé
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æ¬Triton? X-100, Promegaçç»èå¹å
»è£è§£è¯?(CCLR) åæ¥ååºå è£è§£è¯å(RLB)ï¼è¿äºè¯åè¿ä¼æ¾èæå¶æµ·æ´è
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¶ãå¦å¤ï¼PLBæå¶å泡ï¼é常éåé«ééåºç¨ï¼å¯ç¨äºèªå¨åç³»ç»ä¸å°å¹å
»å¨å¤åæ¿ä¸çç»èç»å¶å¤æè£è§£æ¶²å¹¶æµè¯ã
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ç´ é
¶æ¥ååºå æµè¯ç³»ç»æ¹®çè¤ç«è«è§å
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ç´ é
¶(æ¥ååºå 1) åRenillaè§å
ç´ é
¶ (æ¥ååºå 2) æ´»åæ£æµå¨10ç§å
å®æï¼æåæ2ç§çé¢è¯»å»¶è¿ã为äºæ¾ç¤ºStop & Glo TM è¯åæ¹®çæ¥ååºå 1çé«æçï¼å å
¥çä½ç§¯çStop & Glo TM è¯å (缺å°æµ·æ´è
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