《生化危机5》以延续一切故事开端的《生化危机》洋房危机10年后为背景，故事舞台搬到了人类发源地非洲，在这块炎热的大地上拥有并非僵尸也不属于寄生兽的敌人，饱经历练的克里斯(Chris)将与新搭档谢娃(Sheva)共同面对潜藏于黑暗大陆的神秘生化危机。登场敌人部分，除了有玩家所熟悉的生化僵尸犬，貌似巨型蝙蝠的全新登场生化合成怪兽，以及受到寄生而失去理智成为嗜血杀人狂的电锯人、巨斧刽子手等也都将一一登场。
由于浣熊市病毒事件，伞公司已经倒闭，但是危机并没有消失，而在日益加重。为了应付日益严重的生化危机，一个隶属联合国的新组织BASS成立了。混乱的非洲自然是生化危机最严重的地方。BASS得知一个黑军火贩子Iring在非洲交易生化武器，于是派超级战士Chris到非洲追杀Iring。BASS非洲分部指派Sheva作为协助，因为当地人特别反美，即便是BASS也不例外。
chris和sheva过检查站后，kerk在直升飞机上告知他们阿尔法小队已经开始行动，要求他们在指定地点和阿尔法小队汇合。chris和sheva在肉铺和线人接头后领到了装备，很快发现当地人在攻击他们，于是逃入了一个房间，与总部通话后才发现总部早就知道这个情况！他们一路前行，却目睹了线人被砍头，随后他们也被人发现，于是展开了一场大战，最后kerk及时赶到，炸开门，将他们救了出去。
当他们在赶往回合地点路上，传来了阿尔法小队呼救的声音，当他们赶到时，只有队长还奄奄一息，交给了他们一个硬盘，随后他们就遇到了一个长满触手的怪物，最后他们将怪物引入焚烧室将其烧死。
他们从港口杀到海滨小镇，碰到了很多新的敌人，kerk在支援他们时遭到幺蛾子的攻击，失事坠毁，总部命令所有单位向失事地点集结。在失事地点，他们遭到了摩托党的袭击，幸而德尔塔小队救援。德尔塔小队队长Josh将阿尔法小队取得的硬盘上的信息的解密信息交给了chris，而上面有一张图片是jill！
他们继续前进，路过火车站，穿越矿场，结果irving却被一个带面具的人救走，最后德尔塔分队派司机将chris、sheva接走。
路上他们又遇到了飞车党的袭击，当他们摆脱飞车党后，到了集合地却发现德尔塔小队已经全灭，唯独不见josh，突然之间，接他们的那个司机被一个巨人一脚踩扁…… 一场大战后，chris对sheva说，任务已经结束了，她应该回去了。sheva说，那你呢？chris 说总部回传的信息中有他的搭档jill，他要去找她。sheva说你一个人不行，我和你一起去。于是他们一起上了船。
在船上， sheva说，能说说jill的事吗？ chris说我们在浣熊市事件中发现wesker是内奸后就一直在找他的下落。几年前我们得到消息，可能他和spenser（伞公司的创始人）在一起。当我们突袭了spenser的住处，发现spenser已死，而wesker则几乎是一个怪物，身法鬼魅，最后搏斗中jill为了救chris将wesker扑下了悬崖…… 他们继续穿行，向信息中的油田走去。
他们到了油田，又碰到了josh，而josh对自己的行踪却言语不详。他们三个人一起找到了iring，却发现irving 已经上了船，并告诉他们要有一场大烟火等着他们。他们仨在油田爆炸的最后关头，也上了船，及时逃离。
最后他们追上了irving，irving走投无路打了病毒，变成了巨大的怪物，他们打败irving，按irving的临终遗言，走向一个岩洞。
他们在岩洞内发现了一个巨大的遗迹，穿过重重机关后，终于到了图片上显示的实验设施，却发现jill的培养器是空的。
他们继续前行，最后找到了wesker和excella，却发现那个戴面具居然是jill，原来jill和wesker坠崖后并没有死，wesker用控制器将jill的思维控制了，最后他们将jill身上的控制器拔除。并追到了船上。
在船上，他们一路杀过去，追到excella，交火中，excella丢了一种注射剂。
等他们第二次遇到excella，却发现excella变成了巨大怪物，他们奋力打败了这个怪物。
chris接到jill的信息，说wesker要散布病毒，他们找到了wesker，最后挫败了wesker的阴谋并将wesker埋葬于岩浆之中。
wesker一直是终极反派，他死了之后，有人说josh将取代其位置。
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