WB实验干货|实验介绍、蛋白提取、蛋白定量

Question

如题所述

Answer 1

深入解析WB实验：蛋白识别的精密工具

一、蛋白世界中的精密导航：Western Blot实验详解</

Western Blot，简称WB，是一种不可或缺的蛋白分析技术，通过抗原抗体间的特异性结合，揭示细胞内的蛋白动态。其流程犹如一场精密的接力赛：首先，从组织或细胞中提取出关键的蛋白成分（根据样本大小选择相应的裂解液）</，接着进行定量分析，确保每一步都精确无误。随后，蛋白通过SDS-PAGE电泳分离，紧接着在膜上进行转印，封闭步骤为抗体的精确对接做好准备。最后，一抗和二抗依次孵育，化学发光检测揭示出目标蛋白的踪迹。

二、科学配制，搭建实验舞台</

电泳的舞台布置：</将电泳缓冲液的干粉溶解在纯净的水中，确保每一步都清澈透明。
转膜的魔法配方：</转膜缓冲液则以水和甲醇的微妙比例调配，让膜的接纳更为精准。
TBST的引导：</TBST缓冲液，由TBS粉与吐温20和谐共融，为抗体的游走提供稳定环境。
封闭的守护者：</5%脱脂牛奶，以奶粉和TBST的交融，为抗体的结合提供坚固的壁垒。
全副武装的裂解液：</完全裂解液中包含了RIPA裂解液和各种酶制剂，是蛋白提取的终极武器。

三、细致入微的实验步骤</

从组织研磨（根据组织大小调整裂解液）、细胞离心清洗后裂解，再到贴壁细胞的温和处理，每个环节都需精细操作。对于细胞，只需250微升裂解液轻轻触碰，刮取后离心，上清即为珍贵的总蛋白溶液。

提取的蛋白中，一部分要保持活性，通过BCA试剂盒进行定量。关键步骤包括配制25毫克每毫升的蛋白标准储备液，稀释至0.5毫克每毫升的工作液，制作出准确的酶标仪标准曲线。样品浓度调整至曲线范围，加入BCA显色液，37℃反应后对比标准曲线，计算出蛋白的精确浓度。别忘了，温度和时间的控制至关重要，每次测定都要配上标准曲线，稀释充分以保证一致性</，并做好安全防护。