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提要:外来物种入侵被认为是世界范围内对生物多样性的一个巨大威胁,现已成为一个全球化的问题,其危害已随人类的认识水平和估算能力的提高而日益彰显。本文介绍了物种入侵的概念,列举了其危害,讨论了控制物种入侵的一种方法:引入天敌是否是治理物种入侵的最佳方法。 我国亟需对现有的关于外来物种入侵的法律、法规体系进行全面清理,借鉴国际上的先进经验,完善现有的外来入侵物种管理和控制体系,尽快制定出科学有效的《防止外来物种入侵法》和《入侵物种管理法》,为我国防止外来生物入侵,保护生物多样性和生态环境提供法理依据和制度保障。

一、物种入侵的概念及过程。
按照世界自然保护同盟(IUCN)的定义,所谓外来物种,是指那些出现在其过去或现在的自然分布范围及扩散潜力以外(即在其自然分布范围以外或在没有直接或间接引入或人类照顾之下而不能存在)的物种、亚种或以下的分类单元,包括其所有可能存活、继而繁殖的部分、配子或繁殖体。 外来入侵物种则是指从自然分布区通过有意或无意的人类活动而被引入,在当地的自然或半自然生态系统中形成了自我再生能力,并给当地的生态系统或景观造成明显损害或影响的物种。
从新石器时代起农民就不断地移植植物物种、动物物种。17世纪以来,旅行的人们加强了这种混杂,有时结果是好的,但更经常是带来灾难性后果。 随着交通方式的进步、国际贸易和旅游业的发展,外来物种入侵的概率大大增加。一个地域的某物种比过去更经常地被有意或无意地携带或转移到另一个地域,并在缺乏天敌等制约因素的新环境下繁殖、扩散, 进而对当地生态环境、社会经济和人身健康产生难以估量的影响,如众所周知的水葫芦、松材线虫等。随着全球化进程中国际间经贸交流和人员往来的日益频繁,外来物种扩散的规模和速度均超过以往,给人类造成的危害日益加剧。外来物种入侵的方式主要包括以下两种:一是有意引进,包括用于养殖、种植、花卉等目的的引种,用于生物防治、绿化、水土保持、环境保护等目的的引进;二是无意引进,包括随航空、陆路、水路运输工具和压舱水的引入,随进出口货物和包装材料的引入,旅客无意引入等。那么,外来物种究竟是怎样成功“入侵”我国的呢?
在国家环境保护总局南京环境科学研究所的组织协调下,中国自2001年12月开始在全国展开了历史上首次外来入侵物种调查。经过近两年的努力,最近终于摸清了外来入侵物种的底数,本次调查共查明外来入侵物种283种。调查结果显示,在283种外来入侵物种中,39.6%是属于有意引进造成的,49.3%是属无意引进造成的,自然入侵(指物种随风媒、虫媒和鸟媒等媒介自然传播)的仅占3.1%。而在外来入侵的植物中,有一半左右是作为有用植物引进的。 可见,人们对外来入侵物种认识滞后是造成外来物种入侵的最大因素,很多单位和个人对外来物种可能导致的生态和环境后果缺乏足够的认识,对外来物种的引进方面存在很大的盲目性和急功近利的倾向。有些地方和部门,盲目认为外来植物比本地植物好,因此在工作中不注意发掘本地的优良品种,而热衷于从国外引种,极大地增加了外来物种入侵的风险。可以说,“人祸”(人为原因)是外来有害生物入侵的“帮凶”,外来物种入侵问题首先是一个人为的问题。
而外来物种通过各种途径到达某一生态系统,并不是一进入新的生态系统就能形成入侵,而是在一定条件下实现从“移民”到“侵略者”的转变。外来入侵种的入侵是一个复杂的生态过程,这个过程通常可分为四个阶段:
1.侵入:指是生物离开原生存的生态系统到达一个新境;
2.定居:是指生物到达入侵地后,经当地生态条件的驯化,能够生长、发育并进行了繁殖,至少完成了一个世代;
3.适应:是指入侵生物已繁殖了几代,由于入侵时间短,个体基数少,因而种群增长不快,但每一代对新环境的适应能力都有所增强;
4.扩散:是指入侵生物已基本适应生活于新的生态系统,种群已经发展到一定数量,具有合理的年龄结构和性比,并具有快速增长和扩散的能力,当地又缺乏控制该物种种群数量的生态调节机制,该物种就大肆转播蔓延,形成生态“暴发”,并导致生态和经济危害。
但并不是每个物种的入侵都必须完成这四个阶段,如豚草和三裂叶豚草的入侵某一地区并成为优势种群,大约经历三个阶段:第一是入侵阶段,通常呈单株散生或是成小丛;第二是定居阶段,通常呈小斑块或呈大斑块分布,许多干扰生境还没有被占据;第三是稳定阶段,通常呈大群分布,几乎占据了当地所有适于豚草类生长的干扰生境。

二、物种入侵的危害
外来物种的危害极大,一般说来,有以下几点:
1. 直接减少当地物种数量。
2. 间接减少依赖于当地物种生存的物种数量。
3. 改变当地生态系统和景观。
4. 对火灾和虫害的抵抗能力降低。
5. 土壤保持和营养改善能力下降。
6. 水分保持和水质提高能力下降。
7. 生物多样性保护能力下降。
据了解,世界许多国家因外来物种入侵造成的经济损失都很惊人,美国每年损失1500亿美元,印度每年损失1300亿美元,南非损失800亿美元。 IUCN 2003年2月5日发表的研究报告估计,目前,外来入侵物种给各国造成的经济损失每年超过4000亿美元。IUCN还指出:当前,外来生物入侵是导致原生物种衰竭、生物多样性减少的重要原因。
中国首次外来入侵物种调查的结果表明,外来入侵物种已对中国生物多样性和生态环境造成了严重破坏,一些物种在某些地方已经达到难以控制的程度。据中国农业部最新的统计显示,目前已经至少有380种植物、40种动物、23种微生物正“全面”入侵我国,外来入侵物种每年对中国国民经济有关行业造成直接经济损失共计198.59亿元。专家们根据间接经济损失评估模型计算的结果表明,外来入侵物种对我国生态系统、物种多样性及遗传资源造成的间接经济损失每年为1000.17亿元,两项相加,外来入侵物种对中国造成的总经济损失为每年1198.76亿元,为国内生产总值的1.36%。 入侵物种给我国带来的更大灾难是对生态环境的破坏。能够成功入侵的外来物种,往往具有先天的竞争优势,一旦在新的滋生地摆脱了人类的控制和天敌的制约,就会出现爆发性的疯长,排挤本土物种,形成单一优势种群,最终导致滋生地物种多样性、生物遗传资源多样性丧失。
生物入侵经典案例:1859年,当澳大利亚的一个农夫为了打猎而从外国弄来十几只兔子后,一场可怕的生态灾难爆发了。兔子是出了名的快速繁殖者,一只雌兔一年可以产25只兔仔。而且这些野兔发现自己来到了天堂:澳大利亚没有鹰、狐狸这些天敌,与兔子处于同一种小生态 的小袋鼠对它们也没有竞争能力,因此兔子数量剧增。这些野生的兔子吃牧草,啃小麦,剥食树皮草根,所到之处麦苗牧草荡然无存。它们还到处打洞,破坏水源,使良田变荒漠,一些小岛甚至发生了水土流失。当地的农业和畜牧业遭受巨大损失,并使当地有袋类由于食物缺乏而受危。人们筑围墙、打猎、捕捉、放毒等等,办法用尽,而兔灾仍然无法消除。1950年,人们尝试一种控制野兔的新方法。一种能杀死的兔子的病,即粘液瘤病(兔的一种病毒性传染病枣译注),被引入澳大利亚。科学家先将该病传染给蚊子,然后经蚊子再传染给兔子。但是针对兔子的细菌战被证明只是使不断恶化的状况得到暂时缓解,一小部分兔子对这种病毒具有天然的免疫能力,它们在侥幸逃生后又快速繁殖起来。整个20世纪中期,澳大利亚的灭兔行动从未停止过。
克氏原螯虾(procambius clarkii),也就是我们平时吃的小龙虾,我们在垂涎其美味的同时恐怕从没想过他是一种危害极大的入侵种。我国20世纪30~40年代从日本引进,日本于更早时期从美国引种,主要用作食物和宠物。如今在中国分布范围日渐扩大,在我国南方特别是长江流域的诸省市都能见到。螯虾能给堤坝造成危害是由其喜欢穴居的生活习性决定的,它的前端长有一对钳子般的螯足,打洞的速度很快,范围也较大。由于它们经常生活在江、河、水库、池塘和水田等的岸边,因此对于堤坝的危害可能比白蚁的危害更大。它们的洞通常深度1-5米,直径6-12厘米,有垂直洞,也有水平洞,有时洞洞相连,在大堤背水面数十米以内经常发现。这些虾洞往往与管涌形成有关,对堤防危害极大:在1998年长江特大洪灾中,防汛人员在长江荆江大堤章化段巡堤查险发现清水漏洞,开挖处理时在堤身挖出大量螯虾;鄂州长江干堤燕矶段也发现10多起螯虾危害大堤的情况,武汉市汉阳区汉江大堤上黄金口段的一处约100平方米的池塘边就曾发现了37个虾洞,经及时用砂石料填埋,才消除了隐患。它们能在临时性水体中生存,且食性广泛,建立种群的速度极快,易于扩散。对当地鱼类、甲壳类、水生植物极具威胁,破坏当地食物链;因其取食根系而直接对作物(尤其是水稻等水生、半水生作物)和天然植被有灾害性破坏;螯虾食性很杂,对鱼苗发花和1龄鱼种培育有一定程度的影响,并危害人工繁育的幼蚌。由于克氏原螯虾适应性强,抗逆能力强,食性广泛,种群增殖速度快,目前对克氏原螯虾尚无有效的防治方法。

近年来,入侵中国的外来生物呈现传入数量增多、传入频率加快、蔓延范围扩大、发生危害加剧,每年因此而造成的经济和生态损失高达数千亿元,潜在危害更是难以估量。

四、治理措施
中国是世界上遭受生物入侵危害最严重的国家之一,入侵种多、危害严重。目前广泛采取引进新物种的“天敌替代法”有可能是“引狼驱虎”,我国应立足本土生物多样性优势,寻找对付入侵的“本土卫士”。
中科院植物研究所副研究员高贤明博士认为造成生物入侵危机的主要原因就是各地盲目引进各种外来物种,同时在生物入侵的治理中,为追求“立竿见影”的短期效果,各地未经过任何科学的论证和必要的试验,就普遍采取从国外引进天敌和替代物种的“以夷治夷”方式,殊不知这样的做法导致新的生物入侵危险性极高。
近来科学家在四川、云南、贵州等地已发现众多能排挤、抵御外来生物入侵的本土物种,这使中国的生物入侵治理有了新的“转机”。参与中科院“重要外来物种的入侵生态学效应及管理技术研究”项目的专家最近重点对四川省攀枝花市仁和区进行了初步调查,发现在与被称为植物界“食人鱼”的紫茎泽兰生存竞争中最终可以占优势的本土植物有100多种。目前他们正在对这些植物进一步筛选,并在良种选育、采种园建设、栽培技术、管护措施等方面进行深入研究。
另外,我国应尽快制定《防止外来物种入侵法》和《入侵物种管理法》,而且由于外来入侵物种的影响面极大,我国应成立包括农业、林业、环保、海洋、贸易、检疫、卫生、国防、司法、教育、科研等国家主管部门在内的统一管理协调委员会,从国家利益的高度全面管理外来入侵物种。立法时的核心问题是加强和完善对外来物种引入的评估和审批制度,并应充分考虑到入侵种传入的各个环节,针对每一传入途径制定相应的法制管理对策。具体应当包括如下方面:
第一、建立完善的外来物种入侵风险评估体系。
作为国家与地方管理部门早期预警和决策的依据,外来物种入侵风险评估体系的建立势在必行。需要进行风险评估的方面主要有:健康风险、对经济生产的威胁、对当地野生生物和生物多样性的威胁,以及引起环境破坏或导致生态系统生态效益损失的风险等。
应当在立法中明确规定,凡从国外引入,或者从国内跨生态系统引入时,都需要办理申请和经过评估。在充分的科学研究和信息收集整理的基础上,制定我国外来入侵物种的管理名录及评估方法,将其作为法律附件,为司法实践提供科学参考。法律本身可以长期稳定不变,但这些附件应该是动态的,需要根据科学研究的结果更新。
第二、建立外来入侵物种早期预警、监测和快速反应体系。
首先,我国建立外来入侵物种早期预警体系应包括建立国家和省级水平的早期预警工作体系。早期预警单位应该进行野外调查,验证所收到的报告与物种鉴定的结果,以及做出是否需要加强监测的建议。
而且在监测的管理方面,应大力加强有关信息系统的建设,并建立起相应的入侵物种数据库和物种鉴定专家数据库。立法应当明确规定建立定期(年度)普查制度。地方与中央则应分别建立相应的定期报告与公告制度,以便及时汇总信息以发布国家生态安全预警名录,制止外来物种的入侵和蔓延。
另外,我国亟需建立专门的入侵物种快速反应体系。国家环保总局在构建该体系中应发挥积极作用,充分结合各部门已有的和拟建的快速反应机制,使之形成全过程的监督管理体系,实现协调统一和信息共享。
第三,建立完备的预防措施、野外释放试验、清除、控制体系。
预防措施首先要通过立法建立双许可证制度,即从国外引进物种时,均要求有出口国和引进国两个许可证明,从而控制潜在风险物种的进口、出口和转移。另外应当改革现有防范机制,并加强海关执法,强化海关对于物种的非法转移及物种转移的许可文件的检查。
由于外来入侵种常常有停滞期,所以在允许大面积扩大释放之前必须进行一个试验,即在被控制的和可恢复的条件下进行野外释放试验。
如果外来物种产生不良影响,即应迅速制定清除计划。此类计划极易引起更严重的生态破坏,所以必须十分周密,针对不同的情况采用不同的方法,并确保清除方法有效、无污染,而且不能危害人类和本地动植物。清除计划必须确保有足够的立法和机构组织保障,还包括清除后必要的生态系统恢复措施。
但是实际生活中,彻底清除有害生物和物种常常很难,这时只能使用控制计划,将入侵物种控制在可以管理、引起灾害尽量小的状态。控制计划当然也应当通过立法给予保障。
第四、关于责任和费用承担问题
按照“谁受益、谁补偿,谁破坏、谁恢复”的原则,建立完备的生态效益补偿制度[8]。法律应明确规定引入者所必须承担的相应的清除和经济赔偿责任,其中包括进行危险性评估、实验、监测和治理的义务。同时国家行政主管部门通过立法对引种不当的责任机构或人员,予以经济处罚。责任人应向受害者支付补偿费,或受害者可以依法申请国家赔偿。
由于外来物种入侵所造成的经济损失往往极为严重,而预防、清除或控制此种危害,维护现有的生物安全所需要的费用,更是责任人难以承受的天文数字,所以应建立风险分担机制,规定进口单位需要购买责任保险,以将经济风险转移给商业保险公司或社会保险机构。当然,国家和地方政府也必须将控制外来物种入侵种作为生态保护的措施之一纳入财政预算,建立相应的基金。
最后,立法中应明确规定鼓励使用当地物种,外来物种仅在安全和必要的前提下,才能考虑是否引入。

参考文献:《人民网-环保频道》,《新华网》 ,
解 焱. 外来物种入侵、危害及我国的对策研究
高勇 阎彩娥 .中国外来生物入侵调查
环保总局:外来入侵物种每年造成经济损失逾千亿

外来物种入侵的危害

Abstract: the invasion of alien species is considered to biodiversity around the world a huge threat, has now become a global issue, the harm has been with humanity and to estimate the level of awareness and the growing capabilities demonstrated. This paper introduces the concept of invasive species, listed in the hazards, control of invasive species discussed a way: the introduction of natural enemies is the management of invasive species is the best way. China's urgent need of existing invasive alien species on the laws and regulations to conduct a comprehensive clean-up system, drawing on advanced international experience and improve the existing invasive alien species management and control system, as soon as possible to develop a scientific and effective "to prevent the invasion of alien species Law "and" Invasive Species Management Law ", for China to prevent invasion of alien organisms, protection of biodiversity and the ecological environment and systems to provide a legal basis for protection.

First, the concept of species and the process of invasion.

In accordance with the World Conservation Union (IUCN) definition of the so-called alien species is defined as one which appears in its natural past or present distribution outside of the scope and spread of potential (that is, outside its natural range or in the absence of direct or indirect introduction or care of human and can not exist under) the species, subspecies or less taxa, including all of its potential to survive, then part of reproduction, gametes or propagule. Invasive alien species is from the natural distribution area through the intentional or unintentional human activities have been introduced in the local natural or semi-natural ecosystems in the formation of a self-regeneration and to the local ecological system or landscape or the impact of causing significant harm species.

Starting from the Neolithic farmers continue to transplant the plant species, animal species. Since the 17th century, travel to strengthen the people of this mixed, and sometimes the results are good, but more often with disastrous consequences. With the advances in mode of transportation, international trade and tourism development, the probability of invasion of alien species increased significantly. A region of a species more frequently than in the past has been, intentionally or unintentionally, to carry or transfer to another location, and in the absence of natural enemies such as constraint propagation of the new environment, diffusion, and thus the local ecological environment, socio-economic and physical health difficult to assess the impact of water hyacinth, as is well known, such as pine wood. With the globalization process and international economic and trade exchanges and personnel exchanges become increasingly frequent, the spread of alien species are the size and speed than ever before, the harm caused to human beings growing. Invasive alien species include the following two ways: First, intentional introduction, including for breeding, planting, flowers, etc. The purpose of the introduction for biological control, afforestation, soil and water conservation, environmental protection, such as the introduction of purpose; Second, do not intend to introduce , including with the air, land, sea transport and the introduction of ballast water, with the import and export of goods and the introduction of packaging materials, such as passengers do not intend to introduce. So, what is the alien species the success of "invasion" of our country do?

In the State Environmental Protection Administration, Nanjing Institute of Environmental Sciences, the organization and coordination of China since the beginning of December 2001 carried out in the country for the first time the investigation of invasive alien species. After nearly two years of effort, finally find out the base of invasive alien species, the survey identified a total of 283 kinds of invasive alien species. The survey findings revealed that 283 kinds of invasive alien species, 39.6% were caused by intentional introduction, 49.3% is a result of unintentional introduction of natural invasion (referring to the wind-borne species, insect and bird-borne dissemination of various media such as the nature) of only 3.1%. In the alien invasive plants, there are about half as the introduction of useful plants. This shows that people's awareness of invasive species to lag behind the invasion of alien species is the biggest factor, many units and individuals of foreign species may lead to ecological and environmental consequences of the lack of sufficient knowledge of the introduction of foreign species, there are a lot of blindness and the tendency of quick success and instant benefits. Some localities and departments, blindly believe that alien plants better than the local plant, and therefore pay no attention to explore the work of the fine local varieties, and keen on introduction from abroad, greatly increased the risk of alien species invasion. It can be said that "man-made" (man-made causes) Invasive alien species are the "hired guns", the issue of alien species invasion is first and foremost a human issue.

And alien species through various channels to reach a particular ecosystem, not a beginning of the new ecosystem will be able to form the invasion, but under certain conditions, from the "migration" to the "aggressors" changes. The invasion of alien invasive species is a complex ecological processes, this process can generally be classified into four stages:
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第1个回答  2009-06-20
药用真菌桑黄液体发酵工艺的研究

摘 要 目的:研究不同培养基、不同培养条件对桑黄菌丝生长的影响。方法:通过液体发酵培养,并利用L9(34)正交试验筛选出了桑黄液体发酵的优化培养基。结果与结论:玉米粉为最佳碳源,麸皮为最佳氮源,优化培养基配方为:玉米粉5%、麸皮3%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素B1 20μg/100 mL、维生素B2 30μg/100 mL;最适菌丝体生长的液体发酵条件为:培养温度为26 ℃,摇瓶转速130 r/min,pH值6.5,接种量15%~20%,种子液培养时间为5 d,装液量(500 mL三角瓶)为140 mL,发酵时间为7 d。 关键词 桑黄;药用真菌;液体发酵;菌丝产量 Study on liquid fermentation technology of medicative fungus phellinus igniarius YANG Quan,LI Yan�hui,YAN Han�jing,WANG Qi (1. Section of Medical Plant and Pharmacognosy, Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou Guangdong 510240; 2. Chendu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chendu,Sichuan 610041; 3. Faculty of Traditional Chinese Medicinal Crops, Jilin Agricultural University, Changchun,Jilin 130118) Abstract AbstractTo study the effects on mycelia by various media and conditions, including shaking culture and L9(34)orthogonal test. The result showed that corn flourwas the optimalcarbon source andbran is the optimalnitrogen source.The optimalculture mediumwas: corn flour 5%,bran 3%,KH2PO4 0.3%,MgSO4 0.15%,VitB120 μg/100 mL,VitB230 μg/100 mL.The optimalfermented condition was: culture temperature 26 ℃,rotation speed130 r/min, pH 6.5, inoculationsize 15%~20%,incubation time for seed liquid 5 days, the amount of liquid 140 mL(500 mL canonicalflask), and fermentationtime 7 days. Key words Phellinus igniarius;medicinal fungus;liquid fermentation; mycelial yield 桑黄Phellinus igniarius(L.exFr.)Quel [1]属于担子菌亚门,多孔菌科的药用真菌。子实体入药,味微苦,能利五脏,排毒,止血,活血;多用于和胃止泻,民间用于治疗淋病,崩漏带下,癖软,脾虚泄泻。热水提取物对小白鼠的肉瘤S-180的抑制率为87%。艾氏腹水癌的抑制率为80%[2]。传统上,桑黄的活性成分多糖是从子实体中提取,但是,受生理生态的特殊性和复杂性以及外部环境条件的制约,在自然界中形成的子实体稀少,人工栽培难度较大,资源匮乏[3]。所以,桑黄的开发和利用也受到限制。为了解决这个难题,本实验对其液体发酵的工艺进行了研究,筛选出适宜菌丝体生长的液体培养基和生长环境。人工培养菌丝体,提取其活性成分多糖,通过药理实验,结果表明菌丝体多糖和子实体多糖具有相同的药理活性。现仅将液体发酵工艺报道如下。 1 材料与方法 1.1 桑黄菌种 由采自长白山地区的子实体分离获得,经吉林农业大学菌物研究所鉴定。 1.2 原料 大米粉、土豆、小麦粉、玉米粉、麸皮、黄豆、米糠粉等烘干粉碎过60目筛。 1.3 药品 葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、蛋白胨、酵母粉、硫酸氨、稀盐酸(ρ=1%)、稀氢氧化钠(ρ=1%)、维生素B1、维生素B2。 1.4 培养 1.4.1 液体摇瓶种子培养基配方 采用通用药用真菌培养基[4]。其组成(ω/%) :蔗糖 3、蛋白胨0�3、酵母粉0.2、硫酸氨0.2、磷酸二氢钾0.1、硫酸镁0.05。 1.4.2 液体摇瓶种子培养 250 mL摇瓶装液体培养基50 mL,接活化后的斜面母种4块,每块0�5cm2。置旋转式摇床,转速120 r/min,25 ℃震荡培养5 d。即得液体摇瓶种子。 1.4.3 二级摇瓶发酵培养 500 mL摇瓶装液体培养基140 mL,接种量20%(液体摇瓶种子种龄5 d),培养7 d,培养方法同液体摇瓶种子培养。 1.4.4 发酵培养基正交实验 采用玉米粉作碳源,麸皮作氮源,磷酸二氢钾、硫酸镁作为矿质元素,按L9(34)设计三水平四因素试验[5]。九个组合,两次重复,采用500 mL摇瓶随机置摇床培养,见表1。表1 L9(34)试验因素及水平(略) 1.5 测定 发酵液用布氏漏斗过滤后,菌丝体用清水冲洗干净,置60 ℃烘箱烘干至恒重,称量。pH值用pH计测定。菌球大小用测总长度法;菌球密度用平皿划线记数法。 2 结果与分析 2.1 培养基成分对菌丝产量的影响 2.1.1 液体培养基中碳源的确定 碳素是真菌最重要的营养,它不仅是碳水化合物和蛋白质的基本组成元素,同时,又是重要的能量来源[4]。选择10种常见的原料作碳源比较,见表2,试验浓度2%。碳源试验培养基其他组分:蛋白胨1%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,维生素B1 20μg/100 mL,维生素B2 30μg/100 mL。 氮源试验培养基其他组分:葡萄糖3%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,维生素B1 20μg/100 mL,维生素B2 30μg/100 mL。从表2可知桑黄对碳的利用相当广泛,对单糖、寡糖、多糖均可利用。而以大米粉的浸出汁做碳源最好,其次是小麦粉、玉米粉,但是,三者的桑黄菌丝体的产量相差不多。玉米粉来源容易,且成本低,所以本试验选用玉米粉做碳源。表2 不同碳源对菌丝产量的影响(略) 2.1.2 液体培养基中氮源的确定 氮素是真菌合成蛋白质、核酸的必要原料,对菌丝的生长发育至关重要。我们选择6种原料作氮源比较,试验浓度为2%,结果表明不同的氮源对菌丝体生长有明显的差异,麸皮作氮源显著好于其他原料。且麸皮成本低、来源广,所以本试验选麸皮做氮源,如表3。表3 不同氮源对菌丝产量的影响(略) 2.1.3 液体培养基中矿物质元素的确定 据资料报道[6],液体培养基中缺乏P、S、K、Mg,菌丝体生长发育不良,菌丝体产量低。但这四种元素对菌丝体生长作用大小不存在显著差异。同等重要,因此本实验选取常用的磷酸二氢钾和硫酸镁作矿质元素添加。 2.1.4 维生素用量的确定 据资料报道[6]真菌是维生素B1、维生素B2的天然缺陷型,必须外界添加才能生长良好。维生素B1 、维生素B2对真菌的生长相当重要,他们以一种辅酶的形式存在,对菌丝的生长起促进的作用。而他们的需要量甚少,培养基的适宜浓度为10~40 μg/100 mL。根据本试验结果,在液体培养基中维生素B1的用量20μg/100 mL,维生素B2用量30μg/100 mL时,菌丝体的产量最高。 2.1.5 优化培养基配方的确定 综合上述实验结果,又考虑原料来源及成本价格,选用玉米粉作碳源,麸皮作氮源;选用磷酸二氢钾和硫酸镁作矿质元素,进行L9(34)正交试验,结果见表4。采用直观分析法分析正交试验结果,从9组试验的菌丝产量来看第六组试验的菌丝产量最高达到1.47 g/100 mL。较优的组合是A2B3C1D2。而经方差计算所得的较优组合是A2B3C3D2,于是将未做试验的A2B3C3D2的组合和已做过试验的A2B3C1D2的组合进行对比试验,2次重复,测定菌丝干重,试验的结果是A2B3C3D2组合的菌丝产量最高,达到1.58 g/100 mL。所以确定了桑黄的液体深层发酵的培养基配方为:玉米粉5%、麸皮3%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、维生素B1 20μg/100 mL、维生素B2 30μg/100 mL。表4 各组分正交试验结果(略) 2.2 液体发酵条件对菌丝产量的影响 2.2.1 液体种子培养时间对菌丝产量的影响 进行二级摇瓶发酵培养7 d后,测菌丝产量。从菌丝体的产量可以看出,培养5 d的液体种子最适宜接种,菌丝产量最高。同时,观察了培养5 d的液体种子,培养5 d时开始形成大量均匀的菌丝球,表面具放射状小刺,镜检菌丝,有大量的锁状联合,此时菌丝生长正处于增殖期,适宜接种。见图1。 2.2.2 培养温度对菌丝产量的影响 在影响菌丝生长发育的各种物理因素中,温度是最重要的一个因素[7]。本试验设计6个温度梯度进行发酵培养,从菌丝的产量可以看出,26 ℃的发酵培养菌丝产量最高。见图2。 2.2.3 培养基起始pH值对菌丝产量的影响 液体培养基作为菌丝体生活的外部环境,pH值的高低直接影响菌丝体的新陈代谢。据报道[8,9],真菌喜欢在偏酸的环境下生长。本实验设计几个pH梯度进行液体培养,从菌丝的产量来看,pH5.5~6.5之间适宜菌丝的生长,而pH6.5的环境下菌体产量最高,见图3。 2.2.4 摇瓶装液量对菌丝产量的影响 500 mL三角瓶装液量120~160 mL时,菌丝产量较理想,而装液量140 mL最高,说明装液量过多影响了菌丝体的好氧需求,从而影响菌丝的产量。而装液量过少菌丝体所能吸收利用的营养不足而影响菌丝的产量。见图4。 2.2.5 摇瓶转速对菌丝产量的影响 在转速为130 r/min时,菌丝产量最高。转速慢,培养基内的溶解氧少,菌球过大,而菌球中间的菌丝处于饥饿状态,影响菌丝的生长。致使菌丝的生物量降低。转速过快摇瓶内的机械刺激过于强烈,也影响菌丝的生长。同时转速过高,还容易引起培养液的飞溅,弄湿棉塞,引起污染。见图5。 2.2.6 接种量对菌丝产量的影响 以菌丝体干重计,接种量以15%~20%为宜。接种量少,接入的小菌球就少,所形成的大菌球相对就少,随之,菌丝体的产量就少。接种量过多时,小菌球的数量过多,导致培养基内缺氧及培养基内营养成分迅速被消耗,菌丝体无法很好的生长,而影响菌丝体的产量。见图6。 2.2.7 发酵时间对菌丝产量的影响 桑黄菌丝体发酵时间7 d,菌丝体长势最好,产量最高。在初期生长比较缓慢,随着发酵进程的不断深入,菌丝体生长越来越旺盛,到第7天菌丝体产量达到最高峰,之后生长趋于稳定。到第9天菌丝出现自溶现象,生物量有所下降。见表5。表5 发酵时间对菌丝产量的影响 3 讨 论 3.1 摇瓶培养过程中的污染率的控制。一旦发现发酵液有杂菌污染,会造成物力、人力、时间的浪费。发酵液被杂菌污染时,培养液变得混浊,味酸臭,所以降低污染的几率也是试验成败的关键之一。培养基灭菌时要彻底,液体培养基灭菌时一定要严格掌握灭菌程序,时间过长或温度过高都会破坏培养基的营养成分。灭菌时间不足,压力、温度未达到要求,而导致灭菌不彻底都会污染。接种时超净工作台要先打开至少30 min,另外接种过程要严密,动作要稳、准、快,否则污染几率要大大增加。 3.2 在摇瓶培养过程中,振荡频率对菌丝体的生长也有很大的影响。振荡频率过慢菌球形成数量少,导致单个菌球长势过大,菌球中间出现中空状态,而且出现菌丝体自溶现象,另一方面培养基内的溶解氧减少影响菌丝生长,结果菌丝体产量降低。振荡频率过快,培养基容易飞溅到棉塞上引起污染,造成不必要的人力、物力等的浪费。 3.3 用正交实验方法筛选出了菌丝体生长发育的浓度和培养基的配方。适合桑黄菌丝体发酵培养的培养基配方为:玉米粉5%,麸皮3%,磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%,维生素B1 20μg/100 mL 、维生素B2 30μg/100 mL;最适合菌丝体生长发育的理化因子为:摇瓶发酵的适宜温度为26 ℃,摇瓶转数为130 r/min,pH值为6.5,接种量15%~20%,摇瓶装液量为500 mL装140 mL,发酵时间为7 d,液体种子的培养时间为5 d。 3.4 本实验的结果表明利用液体发酵技术,不仅能在短期内能获得大量的桑黄的菌丝体,而且周期短,不受季节和环境的限制。为工业化生产菌丝体提供了依据。为进一步研究其发酵液的生物活性奠定了基础,且可以大幅度地降低桑黄作为新药开发的成本。所以采用液体发酵技术生产桑黄菌丝体将是一种重要的方法,具有广阔的前景。 参考文献 [1]卯晓岚.中国经济真菌[M].北京:科学出版社,1998. 535. 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