荧光素酶报告实验

Question

如题所述

Answer 1

上期为大家介绍了基因的导入方法，基因导入后对于细胞的影响是我们所更关心的。那么如何检测它从哪些方面影响了细胞的正常功能和代谢呢？在解释这个之前，请回忆在中学时就学到的法则——中心法则。它最早在1958年由Francis Crick提出，后经过完善形成现在我们所熟悉的版本（图1）。
图1 中心法则
中心法则提供了一个框架，帮助更好的理解生物体内携带遗传信息的生物大分子（DNA，RNA和蛋白）是如何将这些信息进行传递的，绝大多数生物均遵循这条法则来进行遗传信息的传递。在整个遗传信息的传递过程主要包括DNA复制（DNA－DNA），RNA复制（RNA－RNA），转录（DNA－RNA），逆转录（RNA－DNA），翻译（RNA－蛋白）这几个过程。那么要研究在设定的实验条件下对细胞的正常功能和状态产生的影响，就可以从中心法则中的这几个节点入手，来进行检测。
第一期介绍细胞生物学实验常用的研究思路和方法中，列出常见的检测节点和方法，可以发现这些检测的内容与中心法则的遗传信息传递流有很多的重合，在这里挑选了一些比较常用的检测内容和方法来进行介绍。这一期主要介绍转录水平检测常用的方法——荧光素酶报告系统。
荧光素酶报告实验由于其快捷、廉价、灵敏度高和可定量等优点，已普遍用于细胞生物学的研究，如基因表达转录水平的研究。荧光素酶报告系统属于生物发光系统，其中的荧光素酶来自于不同生物体内的氧化酶，很多物种（细菌、海洋动物、昆虫等）中都含有荧光素酶，其中应用比较广泛的是荧火虫荧光素酶。它可以在一定条件下与底物发生化学反应产生可检测到的光，产生光的过程中几乎不产生热量，也就是说这个过程中几乎所有的能量全部转化为光能，这使得检测的灵敏度非常高（图2）。下面以报告基因实验（启动子）为例，来介绍双荧光素酶报告系统。
图2 荧光素酶反应原理
报告基因实验常用于研究目的基因的调控元件（启动子、增强子等），调控元件的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。整个报告基因的核心是将待定的调控元件与报告基因进行融合，检测报告基因的表达（图3）。由于报告基因的表达完全取决待定的调控元件，故报告基因的表达量与待定调控元件的活性直接相关。一个好的报告基因必须满足以下条件：
（1）在所检测的细胞内不存在；
（2）检测起来非常方便；
（3）灵敏度要高，最好可以定量。相比于传统的β-半乳糖苷酶（LacZ，真核生物内有内源性干扰）、氯霉素乙酰转移酶（CAT，检测复杂）、荧光蛋白（GFP、YFP、RFP等，灵敏度不高，有些细胞有自发荧光现象），荧光素酶检测系统具有明显的优势。
图3 荧光素酶报告实验图解
由于荧光素酶超级灵敏的能力和宽广的动力学范围，荧光素酶系统得到了广泛的使用。通常荧光素酶的实验会将待检测的调控元件（启动子）安排在荧光素酶基因的上游，构建成载体，然后将构建完成的载体导入到合适的动物细胞中，通过检测荧光素酶的活性来判断调控元件的活性。
在荧光素酶报告系统中，只使用一种荧光素酶（一般为荧火虫荧光素酶），为单荧光素酶报告实验；由于不同的荧光素酶所发出的光具有不同的光谱性质，或使用不同的底物，一个报告实验中也可以使用两种或多种荧光素酶，其中最常用到的就是双荧光素酶（一般为荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶）报告实验，其中一种荧光素酶作为报告基因，另一种则作为内参，主要作用是减少外界因素对于实验数据产生的影响，这些影响主要包括操作误差、细胞接种差异、细胞处理的误差、孔间增殖差异等因素。因此，在调控元件（启动子、增强子）的研究中，双荧光素酶报告实验应用的会更多一些，整个的实验过程也非常的简便，如下图所示（图4）。
图4 荧光素酶报告实验流程
具体的实例可参考文献中的方法，如研究人类PDE7A1启动子转录活性[1]（图5）。
图5 hPDE7A1启动子主要的调控元件检测结果
以上部分就是最常用的研究转录因子调控的检测方法和流程，荧光素酶报告系统在科学研究中的应用非常广泛，下面介绍几个在不同领域应用的实例。
（1） 研究信号转导通路：比如研究p53增加I型主要组织相容性复合物表达的信号通路[2]（图6）。
图6 p53通过ERAP1的反应元件调控其转录
（2）研究microRNA靶标：比如研究与趋化因子CCL20相互作用的microRNA筛选[3]（图7）。
图7 miR-21作用于CCL20的靶位点检测
（3）研究蛋白对RNA的降解作用：比如研究锌指抗病毒蛋白对于小鼠白血病病毒的抗感染作用[4]（图8）。
图8 过表达hZAP抑制XMRV的感染
（4）研究蛋白-蛋白相互作用：比如利用基于双荧光素酶系统的Pull down实验来研究蛋白与蛋白相互作用的相对定量[5]（图9）。
图9 基于荧光素酶报告系统的蛋白相互作用检测
（5）药物筛选：比如核受体药物筛选的相关研究[6]（图10）。
图10 药物与受体结合区结合启动荧光素酶的表达
以上就是本期给大家介绍的内容，我们下期见。
参考文献：
[1] Functional characterization of the human phosphodiesterase 7A1 promoter.
[2] p53 increases MHC class I expression by upregulating the endoplasmic reticulum aminopeptidase ERAP1.
[3] miR-21 functionally interacts with the 30UTR of chemokine CCL20 and down-regulates CCL20 expression in miR-21 transfected colorectal cancer cells.
[4] Zinc-Finger Antiviral Protein Inhibits XMRV Infection.
[5] Relative Quantification of Protein-Protein Interactions Using a Dual Luciferase Reporter Pull-Down Assay System.
[6] Improved Dual-Luciferase Reporter Assays for Nuclear Receptors.