国标 饲料中三聚氰胺检测方法

Question

如题所述

Answer 1

普通使用快速检测卡，现在各地畜牧局。兽药监督所都在用，卡是比较方便的，但是这只是初筛，确认还是需要上大型仪器上去。不过现在大家都基本用的卡，比较方便快速。可以买。不过现在这种卡，良莠不齐，建议你们要把好关。质量不好的用了，到时候丢面子更麻烦。比如他标示是检验50ppb，实际上在70ppb这种情况很常见

专业为以下
三聚氰胺(melamine)简称三胺, 学名三氨三嗪, 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式：C3N6H6、 C3N3(NH2)3 。分子量：126.12，是一种重要的氮杂环有机化工原料〔2〕。三聚氰胺显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐。在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物。三聚氰胺与醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、厨房用具、防火纤维、商业滤膜、胶水和阻燃剂，部分亚洲国家，也被用来制造化肥。
2 材料与试剂
2.1 仪器与条件
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国，Agilent公司）；二极管阵列检测器（DAD），检测波长240nm，柱温：40℃。
（1）Agela VenusilTM ASB C18（ 4.6×250mm）；缓冲液：10mM柠檬酸, 10mM庚烷磺酸钠； 流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min。
（2）Agela VenusilTM ASB C8（ 4.6×250mm）；流动相：缓冲液：乙腈=85：15；缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0；流速：1.0mL/min；
离子交换固相萃取柱Agela ClearnertTM PCX(北京艾杰尔科技有限公司)
2.2 试剂与样品
宠物饲料样品（农业部饲料供应中心提供）；甲醇、乙腈为北京艾杰尔科技有限公司提供；氨水、乙酸铅、三氯乙酸、均购于北京化学试剂公司；三聚氰胺标准品、柠檬酸、辛烷磺酸钠（Sigma公司）；甲醇为色谱纯，其他均为化学纯。
3 实验方法
3.1样品前处理方法
(1) 标准样品配制：
取50mg三聚氰胺标准品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的标准溶液，使用时，以提取液(0.1%三氯乙酸)稀释至所要的浓度。

(2) 提取：
称取饲料样品5g，加入50ml 0.1%三氯乙酸提取液，充分混匀，加入2mL 2%乙酸铅溶液，超声20min。然后取部分溶液转移至10mL离心管中，8000rpm/min离心10min，取上清液3mL过混合型阳离子交换小柱(PCX)。

(3) 净化(PCX小柱，60mg/3mL) ：
a) 活化及平衡：3mL甲醇，3mL水
b) 上样：加入提取液3mL
c) 淋洗：3mL水；3mL 甲醇；弃去淋洗液并将小柱抽干。
d) 洗脱：5mL 5%氨化甲醇(v/v)洗脱。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。
e) 浓缩：50℃，氮气吹干，20%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。

3.2 HPLC检测方法

3.2.1 三聚氰胺HPLC-UV检测方法

三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方法和中国农业部公布的三聚氰胺检测方法，采用艾杰尔(Agela) ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分离效果，分析色谱图如下：

图2 Venusil ASB 色谱柱分离三聚氰胺的谱图

(a) 色谱柱：Venusil ASB C8 4.6×250mm；标准：FDA方法；流动相：缓冲液：乙腈=85：15；缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0；流速：1.0mL/min；柱温：40 oC；波长：240nm
(b) 色谱柱：Venusil ASB-C18 4.6×250mm；标准：中国农业部颁标准方法；缓冲液：10mM柠檬酸, 10mM庚烷磺酸钠； 流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min;柱温：40℃；波长：240nm
空白加水平（mg/L） 回收率
0.01 116%
0.1 108%
0.5 92%
2 96%

由上表1可以看出：用PCX柱净化样品，可以得到满意的回收率，此方法处理样品，比FDA公布的前处理方法更加准确、可靠。

3.2.2 三聚氰胺LC-MS检测方法

由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流动相添加了离子对试剂，因此限制了液质联用方法的使用；但不用离子对试剂色谱方法，三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，不能得到较好的分离定量〔3〕。
基于此问题，艾杰尔科技公司自主开发了新的方法，采用艾杰尔(Agela) ASB系列亲水色谱柱，不用离子对试剂也能得到有效的保留与分离。因此方法中流动相不含离子对试剂，可以用于质谱检测。
与FDA 2007年4月公布的《Updated FCC Developmental Melamine Quantitation (HPLC-UV)》相比较，该方法大大降低了最低检测限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm），提高了检测灵敏度。
以该方法分别在ASB-C8 4.6×250mm ASB-C18 4.6×250mm 得到的谱图如下：

图3 LC-MS方法检测三聚氰胺的谱图

缓冲液：10mM的NH4AC；流动相：Buffer:：ACN=95：5；流速：1.0mL/min；进样量：样品先用70%ACN溶解成约1mg/mL，用ACN稀释成0.1mg/mL，进10uL；柱温：40℃；波长：240nm
4 结果与讨论

4.1阳离子交换柱(PCX)

三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物)，净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附剂上，具有阳离子交换和反相吸附两种机理，并具有以下优点：
a) 可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂)，使样品更干净，提高检测的灵敏度。
b) 批次重复性好。
c) 回收率高，重现性好，即使小柱跑干也可以得到较高回收率。

4.2 LC-MS方法优点：

（1）检测过程简便：无须添加离子对试剂，三聚氰胺就可得到良好的保留与分离，避免了配制离子对流动相的复杂过程。
（2）提高了检测的灵敏度：无离子对试剂，可以用于质谱检测器，大大降低了最低检测限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm）。
（3）降低了检测成本：不用离子对试剂，就不再需要买价格较贵的离子对试剂了，从而降低了检测成本。
（4）延长了色谱柱的使用寿命：避免了使用离子对试剂减少色谱柱寿命的影响。
（5）该方法所使用的色谱柱具有通用性：无论是用FDA方法、中国农业部部颁标准方法和本公司开发的LC-MS方法，使用艾杰尔(Agela) ASB系列亲水色谱柱均能得到一个很好的检测结果，从而给客户提供了多种选择空间。