外源基因表达的检测是什么?

如题所述

检测外源基因是否转化成功,首先对报告基因进行检测,然后再进行目的外源基因的检测。目的外源基因的表达可分转录和翻译两个水平,转录是以DNA为模板合成mRNA的过程,翻译则是指以mRNA为模板翻译成蛋白质。目的基因表达检测亦可在两个水平上进行,在转录水平上对mRNA进行检测,在翻译水平上对蛋白质进行检测。

1.报告基因的酶法检测

主要的报告基因,例如Gus基因、Cat基因、冠瘿碱合成酶基因、NptⅡ基因和荧光素酶基因皆可根据各自的功能,采用酶法检测。

2.外源基因转录水平上的检测。

Northern杂交(Northernblotting)以RNA为探针,检测外源基因转录产物特异mRNA。Northern杂交也有斑点杂交和印迹杂交。斑点杂交只需将RNA样品点样在固相膜上直接与探针杂交,但只能鉴定外源基因是否转录;而Northern印迹杂交则需将RNA样品进行电泳分离,然后转移到固相膜上,再与探针杂交,可对外源基因的转录状况进行较详细的分析。Dot-Northern杂交是将总RNA提取物经多孔过滤进样器直接转移到杂交膜上,其余步骤与Northern杂交相同。Northern杂交对细胞中低丰度的mRNA检出率较低。

3.外源基因翻译水平上的检测

外源基因翻译水平上的检测通常用Western杂交(Westernblotting)。Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法。转化的外源基因正常表达时,转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白,将蛋白质样品溶解在含去污剂和还原剂的溶液中,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质分离开来,将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上,膜在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭非特异性座位。然后加入特异性抗体(一抗),印迹上的目的蛋白与一抗结合后,再加入能与一抗特异性结合的二抗,二抗事先已经标记,根据二抗上标记化合物的性质检出。由检测结果,可知目的蛋白是否已在被检植物细胞中表达、其浓度以及大致的分子量。

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