分子杂交技术核酸探针标记法

如题所述

核酸探针类型多样,包括DNA和RNA探针,以及放射性标记和非放射性标记,单链与双链,均匀标记和末端标记。其中,双链DNA探针在基因鉴定和临床诊断中应用广泛。双链DNA探针标记方法主要有切口平移法和随机引物合成法。


切口平移法通过E.coli DNA聚合酶将放射性核苷酸掺入DNA链,产物比活性受多种因素影响,如核苷酸掺入程度和酶的质量。所需材料有DNA模板、未标记dNTP、特定酶等。操作步骤包括配比混合、水浴反应、终止反应及沉淀回收探针。


随机引物合成法利用Klenow酶合成DNA探针,其产物长度和比活性取决于反应条件,如模板、引物和酶的量。随机引物反应的优点在于反应稳定、模板要求宽松和比活性高。所需材料包括随机引物、缓冲液和相关酶。操作步骤包括混合反应、保温、终止、沉淀和保存探针。


单链DNA探针通过克隆序列合成或反转录RNA合成,以解决双链探针错配问题。从M13载体衍生序列合成的方法涉及Klenow片段的使用,而RNA为模板的cDNA探针则通过反转录酶制备。


以上各种探针标记方法各有其特点和应用,需要根据实验需求选择合适的方法,并注意反应条件的控制和产物的纯化。




扩展资料

互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。

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