怎么设计原位杂交探针啊

Question

如题所述

Answer 1

1.探针分为好多种，你要先决定你用何种，是RNA探针还是DNA探针，杂交时，RNA－RNA结合的稳定性要比DNA－RNA好，所以RNA探针具有结合牢固、背景低等优点；DNA探针背景稍微深一些，不过也可以，标记方法比前者简单一些，另外还有寡核苷酸探针，此类探针分子量小，通透性好，但就是标记的敏感性不高。
2.原位杂交相比免疫组化，定位相对准确，但如果蛋白在间质中发挥作用，原位杂交就检测不出来了，结合图像分析，原位杂交也可以对目的基因的转录半定量。
3.首先是标本对照，这个包括阳性对照和阴性对照；第二个是探针对照，主要是明确探针的特异性；第三个是探针正义连阴性对照，第四个未标记探针竞争抑制；第五个不含探针的阴性对照；第六个质粒对照，第七个无关探针对照。
4.若要定量，该试验不可行，还是作Northern，若要显示形态、定位，最好结合免疫组化。
5.罗氏有试剂盒，还不错。追问

多谢。我选择的是RNA探针。能不能告诉我具体怎么根据DNA序列设计出探针序列啊？

追答

一、质粒提取：按试剂盒说明书。
二、质粒线形化
小量酶切：
器皿：0.5 ml小离心管， 1.5 ml离心管，小枪头，中枪头
试剂：灭菌ddH2O，10×EcolRⅠ限制酶buffer,BSA(牛血清蛋白)，质粒DNA，EcolRⅠ
器械：电泳槽，水浴锅，
灭菌ddH2O 13.3μl
10×buffer 2μl
BSA 0.2μl
质粒DNA 4μl
混匀后加入EcolRⅠ 0.5μl。
离心收集至管底，37℃水浴3.5小时。
电泳检测，用宽梳子，小电泳槽，90V，20分钟 （应该用每个质粒和酶切结果作对照）拍照
大量酶切
灭菌ddH2O 110μl
10×buffer 20μl
BSA 2μl
质粒DNA 60μl
混匀后加入EcolRⅠ 8μl 共 200μl 其余与小量酶切一样
三、模板的纯化回收
1、 清洗电泳槽和胶板，用干净的新配制的TAE制胶，填充电泳槽，交制得应尽稍厚些。
2、 200μl酶切样品中加入10μl上样缓冲液，混匀，点样。(加样时应徐徐加入，避免产生气泡样品飘上来，造成样品交叉污染。)
3、 90∨电压下电泳2-3小时，由于样品量较大，电泳时间较长。为了使条带进两分开，不能用太高电压。
4、 切胶，试剂盒回收DNA
四、体外转录合成RNA探针
1、1.5ml管中依次加
DNA模板 10μl
Transcription buffer 5× 4μl
DTT(100mM) 2μl
Dig RNA Labeling mix 2μl
Sp6酶 2μl
RNA酶抑制剂 0.5μl
封口膜封口，混匀，离心，37℃ ，2小时 2小时后，再次酒精棉球擦拭
2、 管中加2μl RNA-free DNaseⅠ,消化DNA模板，封口膜封口，混匀，离心
37℃ 15min (同时取出0.2M EDTA化冻，4M LiCl、无水乙醇、70%乙醇)取出后，离心
3、 管中加2μl0.2M EDTA(pH8.0),终止反应
4、 管中依次加入2.5μl(0.1V)4M LiCl,75ml(2.5V)无水乙醇，沉淀RNA, 封口膜封口，混匀，离心
-70℃ 30min(or -20℃,2h) (同时预冷离心机)
5、4℃，13000rpm 离心，15min
6、倒掉上清，加50μl预冷70%乙醇，将沉淀弹起，冰上or冷冻离心机内静置10~15min
7、4℃，13000rpm 离心，10min
8、倒掉上清，真空干燥10~15min，25μl DEPC水回溶
9、取样1~2μl用于检测（110V,10min,小胶）余下加0.5μl RNA酶抑制剂，-70℃贮存
具体一些量根据你的DNA而定

追问

亲……我问的是怎么设计探针啦……